Син священика, за що в народі прозваний «поповичем». Батько був парохом в м. Ходорків на Житомирщині, а згодом в м. Красний Колядин на Прилуччині. Перейшовши разом із батьком на Лівобережжя, служив сотенним писарем у Красному Колядині, потім сотником веприцьким Гадяцького і красноколядинським Прилуцького полків. За гетьманування І. Брюховецького в 1665 р. став охочекомонним полковником. Неодноразово виконував дипломатичні й військові місії. За Д. Многогрішного - полковник чернігівський (1668—1669 рр.) і генеральний суддя. Після усунення Д. Многогрішного обраний гетьманом. Уклав з московським урядом Конотопські статті 1672 р. Прагнучи об'єднати під своїм регіментом Лівобережну й Правобережну Україну, вів боротьбу проти П. Дорошенка. В 1674 р. був визнаний правобережним гетьманом, фактично став ним після зречення П. Дорошенка в 1676 р. Порушував також питання про приєднання до Гетьмащини слобідських полків, але наштовхнувся на рішучий спротив Москви. В зовнішній політиці був противником польсько-московської згоди коштом України. Змушений відступити з Правобережжя перед турецькою навалою (Чигиринські походи 1677—1678 рр.), наказав примусово переселити місцеву людність на лівий берег Дніпра. У внутрішній політиці був прихильником сильної авторитарної гетьманської влади. Хотів забезпечити спадковість гетьманської булави за своїми синами, яким надав полковницькі уряди й великі маєтки. Водночас щедро роздавав землі старшинській верстві. За І. Самойловича Лівобережна Україна вступила у період відносно стабільного розвитку. Відновилося господарство, швидко розвивалися торгівля й промисли, відродилося культурне життя. Коштом гетьмана збудовано ряд соборів, в т. ч. у Мгарі. Поруч із тим завершився процес опанування Москвою української церкви, яка в 1686 р. опинилися під зверхністю московського патріарха. Самовладство й деспотизм І. Самойловича викликали опозицію серед вищої козацької старшини, яка влаштувала змову проти гетьмана. Після невдачі кримського походу російсько-українського війська 1687 р. І. Самойлович був звинувачений в таємних зносинах із татарами і позбавлений гетьманства на козацькій раді на Коломаці. Невдовзі його було заслано до Сибіру. Через два роки помер у Тобольську.

Мав трьох синів. Старший Семен (1660-1685), одружений з онукою гетьмана І. Сулими, був полковником стародубським (1680-1685 рр.) і наказним гетьманом (1679-1680 рр.). Григорій (?-1687), зять гетьмана І. Брюховецького, був полковником чернігівським (1685—1687 рр.) і наказним гетьманом (1687 р.). Завзятий противник Москви, був заарештований росіянами після Коломацького перевороту й страчений у Сєвську. Яків (7-1695), полковник стародубський (1685—1687 рр.) був заарештований разом із батьком і засланий в Єнісейськ, а потім у Тобольськ, де й помер. Небіж Михайло, полковник гадяцький (1678—1687 рр.) й московський стольник, за участь у змові проти гетьмана І. Мазепи в 1692 р. був засланий у Тобольськ.